附件：乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）（2024年第1號）.doc

乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸檢測試劑注冊
審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。如申請人認(rèn)為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究內(nèi)容，可自行補充。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以HBV基因序列為檢測靶標(biāo)，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進(jìn)行體外定量檢測的試劑。結(jié)合臨床表現(xiàn)和其他實驗室指標(biāo)，可作為乙型肝炎輔助診斷的指標(biāo)之一，還可通過對血液中HBV DNA濃度的檢測可用于HBV感染的輔助診斷、治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

本指導(dǎo)原則適用于實時熒光PCR方法的HBV DNA定量檢測試劑的治療監(jiān)測用途，定性及其他類同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導(dǎo)原則，但應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內(nèi)容是否適用。如不適用，應(yīng)另行選擇符合自身方法學(xué)特性的技術(shù)要求或評價方法。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊申報和相關(guān)變更注冊。

本指導(dǎo)原則不適用于國家法定血源篩查用HBV DNA檢測試劑。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣犹崛》绞綉?yīng)分別明確）和PCR擴增的時間，以及檢測全過程所需的時間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶標(biāo)，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。應(yīng)著重從方法學(xué)及檢出限等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

乙型肝炎病毒DNA檢測試劑已有國家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求，并使用國家標(biāo)準(zhǔn)品對三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗。

乙型肝炎病毒DNA檢測試劑的檢出限水平應(yīng)符合國家相關(guān)指南文件規(guī)定，申報產(chǎn)品對國家最低檢出量參考品的檢測結(jié)果應(yīng)與聲稱的檢出限水平相當(dāng)。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。

如申報產(chǎn)品適用不同的機型，需要提交采用不同機型進(jìn)行性能評估的資料。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗證。

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的乙型肝炎病毒陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平，提交具體的試驗資料。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實樣本，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒進(jìn)行分析性能評估。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩(wěn)定性

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行詳細(xì)研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進(jìn)行性能驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

2.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。應(yīng)提交對不同樣本類型一致性的驗證，包括不同抗凝劑、采血管的驗證或要求。

2.3正確度

對測量正確度的評價依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收試驗、方法學(xué)比對等方法，企業(yè)可根據(jù)實際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

 2.3.1國家/國際參考品驗證

此類檢測試劑有相應(yīng)的國家/國際參考品，應(yīng)使用國家/國際參考品對試劑進(jìn)行驗證，重點觀察對相應(yīng)參考品檢測結(jié)果的符合情況。

2.3.2方法學(xué)比對

采用參考方法或國內(nèi)/國際普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類試劑作為對比方法，與擬申報試劑同時檢測一批臨床樣本，從測定結(jié)果間的相關(guān)性了解擬申報試劑與參比方法間的一致情況。如顯著相關(guān)，說明兩檢測系統(tǒng)對臨床樣本測定結(jié)果基本相符，對同一份臨床樣本的醫(yī)學(xué)解釋，擬申報試劑與對比方法相比不會產(chǎn)生顯著差異結(jié)果。
    在實施方法學(xué)比對前，應(yīng)分別對擬申報試劑和對比試劑進(jìn)行初步評估，只有在確認(rèn)兩者都分別符合各自相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方可進(jìn)行比對試驗。方法學(xué)比對時應(yīng)注意質(zhì)量控制、樣本類型、濃度分布范圍并對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3.3回收試驗。用于評估定量檢測方法準(zhǔn)確測定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示。通常對樣本進(jìn)行3～5次回收試驗，取平均值即平均回收率。

回收試驗注意事項：

2.3.3.1加入的標(biāo)準(zhǔn)液體積一般應(yīng)小于樣本體積的10%；

2.3.3.2盡量使加入標(biāo)準(zhǔn)液后樣本中的被測物濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平；

2.3.3.3標(biāo)準(zhǔn)物的濃度應(yīng)該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本；

2.3.3.4注意基質(zhì)效應(yīng)，盡量采用與臨床待測樣本一致的基質(zhì)。

2.4企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細(xì)的試驗數(shù)據(jù)。

2.5精密度

應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

采用臨床樣本進(jìn)行精密度評價，應(yīng)至少包含4個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、弱陽性樣本、強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：不含乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的樣本，不得檢出陽性（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢出限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

弱陽性樣本：待測物濃度呈弱陽性（高于定量限濃度1個數(shù)量級附近），陽性檢出率為100%且變異系數(shù)（CV）符合標(biāo)準(zhǔn)要求（n≥20）。

強陽性樣本：待測物濃度呈中度至強陽性，陽性檢出率為100%且變異系數(shù)（CV）符合標(biāo)準(zhǔn)要求（n≥20）。

2.6 檢出限

2.6.1最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進(jìn)行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。定量限應(yīng)高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結(jié)果符合試劑正確度要求的最低病毒水平作為定量限。

2.6.2最低檢出限和定量限的驗證

申報試劑應(yīng)在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗證，每個型別至少采用5個樣本。

定量限的驗證應(yīng)對不同基因型（至少包括B、C、D型）進(jìn)行驗證。

企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限/定量限驗證的各個病毒株的來源、型別確認(rèn)及滴度確認(rèn)試驗等信息。

2.7.線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用經(jīng)確認(rèn)為陰性的混合人血清或血漿，應(yīng)包含不少于9個濃度（應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個批次的試劑進(jìn)行試驗。通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的正確度確定該產(chǎn)品的線性范圍。

2.8包容性：HBV不同基因型的覆蓋

應(yīng)對乙肝病毒不同基因型的樣本進(jìn)行檢測，重點考察各基因型病毒樣本的檢出限及重復(fù)性指標(biāo)，每個基因型的病毒樣本稀釋成3個濃度水平，對每水平樣本進(jìn)行重復(fù)測定。

注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。

2.9分析特異性

2.9.1交叉反應(yīng)

用于HBV DNA檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。

建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。

申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項中有所體現(xiàn)。

2.9.2干擾物質(zhì)

潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（見表2）和常用的治療藥物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。

使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)條件下進(jìn)行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗證。

建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。

2.10溯源性

應(yīng)提交詳細(xì)的溯源性研究資料。企業(yè)制備的企業(yè)內(nèi)部參考品、二級參考品、用于制備商品化校準(zhǔn)品的儲備液以及不同基因型的陽性樣本均應(yīng)能夠溯源至國家參考品/國際參考品。使用國家參考品/國際參考品為校準(zhǔn)品，應(yīng)用多臺儀器對企業(yè)一級參考品進(jìn)行校準(zhǔn)，以下逐級對企業(yè)二級參考品、校準(zhǔn)儲備液、陽性參考品進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.11核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸（DNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。

2.12 反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

3.穩(wěn)定性研究

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4.陽性判斷值研究

對于此類試劑，正常人群中不應(yīng)檢出HBV DNA，參考值確定資料主要是指Ct的確認(rèn)資料，申請人可采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。提交所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價和驗證。

5.1.4質(zhì)控品

HBV DNA定量檢測試劑的質(zhì)控品應(yīng)至少設(shè)置三個量級水平的系列質(zhì)控品：臨界陽性質(zhì)控品、強陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對各種質(zhì)控品結(jié)果做出明確的范圍要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線，但又不能對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性，對內(nèi)標(biāo)的結(jié)果應(yīng)有明確的范圍要求。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品建議采用臨床樣本，不宜使用質(zhì)粒。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：應(yīng)包含不同基因型別，陽性參考品的亞型以及濃度需經(jīng)過可靠方法進(jìn)行確認(rèn)。

陰性參考品：可采用經(jīng)確認(rèn)無HBV感染的臨床樣本，還應(yīng)考慮對交叉反應(yīng)的驗證，納入其他近似病原體感染樣本。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平，應(yīng)明確參考品中靶核酸的濃度水平。

重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。如有必要，建議同時設(shè)置陰性參考品進(jìn)行驗證。

線性參考品：建議濃度設(shè)置盡量覆蓋線性范圍，濃度間隔均勻。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料?；旧a(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

（四）臨床試驗研究

1.研究方法

對于該類試劑已有同類產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱試驗體外診斷試劑）與之進(jìn)行對比試驗研究，證明試驗體外診斷試劑與已上市產(chǎn)品一致性。對比試劑在預(yù)期用途、適用人群、樣本類型、檢測方法學(xué)、檢測性能等方面應(yīng)與試驗體外診斷試劑具有較好的可比性。

2.臨床研究單位的選擇

建議申辦者在選擇臨床研究單位時，應(yīng)考慮到各試驗單位的代表性，臨床研究單位應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，試驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個試驗中，試驗體外診斷試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床試驗機構(gòu)應(yīng)執(zhí)行同一臨床試驗方案，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申辦者的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗進(jìn)程，特別是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的受試者入組/排除標(biāo)準(zhǔn)，試驗中剔除的受試者應(yīng)在臨床試驗小結(jié)和報告中詳細(xì)列出，并說明理由。

4.受試者選擇及樣本類型

對于定量檢測，應(yīng)針對主要評價指標(biāo)進(jìn)行樣本量估算。臨床試驗方案中建議同時給出與所選定評價指標(biāo)對應(yīng)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，并提供確定依據(jù)。入組樣本應(yīng)在線性范圍內(nèi)的各個濃度水平均應(yīng)有一定量的樣本例數(shù)，并著重考慮對醫(yī)學(xué)決定水平的檢測性能進(jìn)行充分驗證。

建議臨床試驗應(yīng)樣本數(shù)不少于500例，其中應(yīng)主要選擇乙型肝炎患者樣本（陽性樣本），不少于450例。在受試者選擇時應(yīng)考慮到地域性的差別，應(yīng)涵蓋不少于10例D基因型，應(yīng)注重不同藥物治療的乙型肝炎患者。陽性樣本應(yīng)覆蓋試劑線性范圍，高、中、低值均有一定量的分布。建議選擇不少于50例的陰性樣本進(jìn)行比對試驗，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應(yīng)情況，應(yīng)選擇其他類肝炎病毒感染、其他良性或惡性肝臟疾病患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應(yīng)為實際臨床檢測中常用的樣本類型。對于同時能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，如臨床前研究證明分析性能沒有差異，臨床試驗中可進(jìn)行匯總統(tǒng)計。    

臨床研究應(yīng)以新鮮樣本為主，如采用既往樣本應(yīng)另行說明 。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，定量檢測的體外診斷試劑臨床試驗評價指標(biāo)通常包括回歸分析的回歸系數(shù)、截距、相關(guān)系數(shù)和決定系數(shù)等。采用Bland-Altman法，計算一致性限度，評價兩種檢測結(jié)果的一致性。一致性限度應(yīng)在臨床所能接受的界值范圍內(nèi)。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有不一致（檢測結(jié)果差異較大）的樣本，可采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑進(jìn)行確認(rèn)試驗，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

7.臨床試驗報告撰寫

根據(jù)《醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》、《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求撰寫臨床試驗小結(jié)與報告，并且滿足簽章等要求。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1試劑盒用于定量檢測人血清、血漿等樣本中的HBV DNA，適用樣本類型應(yīng)依據(jù)申報產(chǎn)品的分析性能評估和臨床研究情況進(jìn)行確認(rèn)。明確說明該檢測試劑不得用于血源篩查。

1.2臨床用途：主要適用于接受抗病毒治療的乙型肝炎患者，通過對乙型肝炎患者血中HBV DNA基線水平和變化情況的監(jiān)測，用于評估抗病毒治療的應(yīng)答和治療效果監(jiān)測。

  如有其他用途（如隱匿性感染的輔助診斷）則應(yīng)對產(chǎn)品適應(yīng)癥人群、預(yù)期用途另行說明，并提供與之相應(yīng)的分析性能評估以及臨床驗證等資料。本指導(dǎo)原則內(nèi)容僅針對治療監(jiān)測用途進(jìn)行要求。

1.3說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇以\斷方法；說明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥及背景情況；說明被測分析物與臨床適應(yīng)癥的關(guān)系。應(yīng)當(dāng)說明該試劑檢測結(jié)果不得作為患者病情評價的唯一指標(biāo)，必須結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進(jìn)行綜合分析。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒所包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，如校準(zhǔn)品、陰/陽性質(zhì)控品含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號或備案號（如有）及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、備案號（如有）以及配套儀器等詳細(xì)信息。

2.4校準(zhǔn)品應(yīng)明確溯源性。

3.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲存條件及效期。

4.【樣本要求】

4.1樣本收集要求：結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）推薦的采樣要求。

4.2血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。

4.3樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規(guī)定。

5.【適用機型】注明所有適用的儀器型號

6.【檢驗方法】詳細(xì)說明試驗操作的各個步驟，包括：

6.1試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項。

6.2詳述待測樣本、相關(guān)校準(zhǔn)品及質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

6.3核酸提取/純化方法的詳細(xì)介紹。

6.4擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

6.5 PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及相關(guān)注意事項。

6.6儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況對待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。

6.7基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

6.8校準(zhǔn)方法的描述。

6.9試驗的有效性判斷：試劑盒內(nèi)陰/陽性質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)的Ct值要求。

7.【檢驗結(jié)果的解釋】

檢驗結(jié)果應(yīng)用IU/ml表示，結(jié)合陰、陽性質(zhì)控結(jié)果，對低于檢出限未檢出、低于定量限、檢測范圍內(nèi)及高于檢測范圍的檢測結(jié)果分別進(jìn)行界定。

8．【檢驗方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.2不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運、儲存及處理過程均有可能導(dǎo)致錯誤的檢測結(jié)果。

8.3明確該試劑僅限于規(guī)定的樣本類型及適用機型。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】詳述以下性能指標(biāo)：

9.1對相應(yīng)國家參考品的符合情況。

9.2最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗證所采用的基因型。

9.3精密度：對精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

9.4線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)等信息。

9.5包容性：對不同基因型的覆蓋，驗證該試劑對HBV不同基因型的檢測效果。

9.6特異性：

9.6.1臨床特異性：應(yīng)采用一定數(shù)量的臨床HBV DNA陰性樣本進(jìn)行驗證。

9.6.2交叉反應(yīng)：易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

9.6.3干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應(yīng)注明可接受的最高限值。

9.6.4藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結(jié)果的影響，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。

9.7臨床試驗：簡要介紹臨床試驗方法和結(jié)果。

10.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

10.1有關(guān)人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組分作為潛在傳染源對待。

10.2臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》配備設(shè)備及操作人員，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

三、參考文獻(xiàn)

[1]國家市場監(jiān)督管理總局.《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》：國家市場監(jiān)督管理總局令第48號[Z].

[2]國家市場監(jiān)督管理總局.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》：國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第122號[Z].

[3]國家市場監(jiān)督管理總局.《定量檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則：國家藥品監(jiān)督管理局通告2022年第32號[Z].

[4]國家市場監(jiān)督管理總局.《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》：國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年72號[Z].

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[7]莊輝，美國《慢性乙型肝炎病毒感染管理治療流程：2021年修訂》簡介[J]，中華肝臟病雜志2022年2月第30卷第2期.