附件：腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）性能評(píng)價(jià)通用注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2019年第83號(hào)）.doc

腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）性能評(píng)價(jià)通用注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則所述腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)主要是指基于高通量測(cè)序（high-throughput sequencing）即下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS），又稱為大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS），體外檢測(cè)人體組織腫瘤細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)基因變異。用于檢測(cè)體細(xì)胞突變的NGS正在廣泛用于腫瘤診療相關(guān)的分子檢測(cè)，包括對(duì)特定基因的DNA/RNA進(jìn)行測(cè)序，以尋找與腫瘤臨床診療相關(guān)的基因變異。腫瘤基因突變類型包括點(diǎn)突變、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常等廣義的基因突變。

基于NGS測(cè)序原理的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）檢測(cè)可能包括以下步驟：樣本收集、處理和保存、核酸提取及處理、文庫(kù)制備、測(cè)序和堿基識(shí)別、序列比對(duì)、變異識(shí)別和過濾、變異注釋和解讀以及檢測(cè)報(bào)告的生成。同時(shí)，某些產(chǎn)品還可能會(huì)包括軟件部分，但上述相關(guān)步驟并不一定被全部包括，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體設(shè)計(jì)流程來進(jìn)行判斷。對(duì)于每個(gè)檢測(cè)步驟，申請(qǐng)人需要結(jié)合產(chǎn)品設(shè)計(jì)和臨床意義來建立特定的可接受的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)和合格判斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，為滿足產(chǎn)品特定預(yù)期用途，申請(qǐng)人需通過科學(xué)和適當(dāng)?shù)臋z測(cè)性能研究來確定適用的試劑、消耗品、儀器和軟件?；谏鲜隹紤]因素，NGS檢測(cè)產(chǎn)品的設(shè)計(jì)和工作流程中的任何差異均可能導(dǎo)致結(jié)果的不同，因此申請(qǐng)人需要清楚地描述相關(guān)檢測(cè)性能指標(biāo)。

分析性能評(píng)價(jià)的初衷在于提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問題的假設(shè)，然后通過研究進(jìn)行確認(rèn)。NGS在測(cè)序通量及發(fā)現(xiàn)未知基因變異方面具有優(yōu)勢(shì)，但是在NGS技術(shù)應(yīng)用需求及使用中存在包括相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測(cè)內(nèi)容、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等各方面的挑戰(zhàn)。

本指導(dǎo)原則將重點(diǎn)關(guān)注實(shí)體瘤中檢測(cè)具有臨床意義的體細(xì)胞變異和確保高質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果。申請(qǐng)人應(yīng)以患者的利益為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對(duì)于精準(zhǔn)診治的觀點(diǎn)，并充分考慮在我國(guó)推廣應(yīng)用的可操作性。申請(qǐng)人可采用多樣化的靶向基因組合檢測(cè)。由靶向基因產(chǎn)生的信息可能會(huì)被用于診斷分類，指導(dǎo)治療決策，和/或?yàn)樘囟[瘤提供預(yù)后評(píng)價(jià)，不同產(chǎn)品包含的基因數(shù)量可能存在較大差異。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于全外顯子檢測(cè)、腫瘤全基因組測(cè)序、從頭測(cè)序、游離DNA檢測(cè)、RNA直接測(cè)序、病原體微生物及宏基因組學(xué)測(cè)序、胚胎植入前檢測(cè)、疾病風(fēng)險(xiǎn)（含遺傳風(fēng)險(xiǎn)）評(píng)估與預(yù)測(cè)、直接面向消費(fèi)者測(cè)序及健康人群篩查。

二、NGS性能評(píng)價(jià)

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。

申請(qǐng)人在計(jì)劃開發(fā)一個(gè)有針對(duì)性的基因檢測(cè)試劑時(shí)，需確定其預(yù)期用途、待測(cè)基因數(shù)量、檢測(cè)突變位點(diǎn)或者突變類型，包括將要檢測(cè)的樣本類型、適用人群以及哪些類型的檢測(cè)信息將被評(píng)估和報(bào)告。還應(yīng)考慮影響檢測(cè)的設(shè)計(jì)、驗(yàn)證和質(zhì)量控制的其他因素，并在試劑組成說明書中詳細(xì)說明該產(chǎn)品包含的試劑組分及需要但未提供的試劑、設(shè)備及耗材。

作為IVD檢測(cè)一般原則，申請(qǐng)人應(yīng)首先定義申報(bào)產(chǎn)品的預(yù)期用途和檢測(cè)性能，產(chǎn)品的預(yù)期用途將直接影響檢測(cè)設(shè)計(jì)和檢測(cè)性能以及測(cè)序和/或報(bào)告的基因類型。申請(qǐng)人需要前瞻性地確定應(yīng)進(jìn)行的研究指標(biāo)（例如準(zhǔn)確性）以及每種研究指標(biāo)應(yīng)該滿足的標(biāo)準(zhǔn)。在設(shè)計(jì)和開發(fā)完成之后，驗(yàn)證研究其是否滿足預(yù)定義的性能。如果檢測(cè)不符合任何預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)分析原因、重新驗(yàn)證或修改預(yù)定義的性能指標(biāo)。通過反復(fù)的設(shè)計(jì)、開發(fā)和驗(yàn)證，直到檢測(cè)滿足設(shè)定需求。在整個(gè)過程中申請(qǐng)人需要記錄所有研究方案、研究過程和結(jié)果以及每項(xiàng)研究設(shè)計(jì)的理由。建議申請(qǐng)人列出樣本處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、生信分析等環(huán)節(jié)主要質(zhì)量控制參數(shù)。如文庫(kù)濃度及片段長(zhǎng)度、堿基識(shí)別質(zhì)量值（Base Call Quality scores）、過濾后有效Reads數(shù)、有效測(cè)序深度（如經(jīng)過去重處理等）、符合最低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度要求的區(qū)域（%）等。

申請(qǐng)人應(yīng)提供整個(gè)檢測(cè)流程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件（Standard Operating Procedure，SOP），對(duì)NGS技術(shù)檢測(cè)全過程包括的樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等過程進(jìn)行描述。生物信息學(xué)分析方面描述和記錄數(shù)據(jù)處理和分析，包括變異識(shí)別、過濾和注釋的所有過程。明確所有要使用的軟件，包括來源（例如：內(nèi)部開發(fā)以及第三方）以及主要修改。建議以列表形式描述所有需要的軟件和/或數(shù)據(jù)庫(kù)名稱、版本及其功能。

（二）主要原材料的研究資料

NGS檢測(cè)過程主要包括樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等。

1.樣本收集處理（如適用）

樣本收集處理過程是保證樣本具有能如實(shí)反映患者體征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。申請(qǐng)人需提交涉及樣本收集及處理相關(guān)試劑主要原材料信息，如樣本前處理試劑、樣本運(yùn)輸保存試劑、核酸提取試劑的主要組成成分等。

2.文庫(kù)制備及測(cè)序

測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序過程中所需試劑主要包含脫氧核糖核苷三磷酸、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭等；如為申請(qǐng)人自行研究的主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)過程予以詳述；并提供對(duì)各主要原材料的功能性研究。并對(duì)制備完成的原料成品進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，且整個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請(qǐng)人外購(gòu)的主要原材料，應(yīng)詳述每一種原材料外購(gòu)方來源，提交外購(gòu)方出具的每種原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請(qǐng)人對(duì)外購(gòu)主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease,DNase）和核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）污染。

3.生物信息分析及數(shù)據(jù)庫(kù)要求

NGS的數(shù)據(jù)分析流程或生物信息學(xué)流程一般可以分為堿基識(shí)別、序列比對(duì)、變異識(shí)別和變異注釋等。明確參考序列類型，不同突變類型可能需要開發(fā)不同的變異/突變檢測(cè)算法。其次，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)類型提供軟件工具的范圍和所需的驗(yàn)證類型。如涉及數(shù)據(jù)庫(kù)使用，建議申請(qǐng)人提交數(shù)據(jù)庫(kù)的溯源信息、數(shù)據(jù)庫(kù)類型、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及分析軟件的版本、性能驗(yàn)證等資料。

4.參考品要求

內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過程、定值研究及評(píng)價(jià)指標(biāo)等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行驗(yàn)證，并提供參考品溯源過程的測(cè)量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

具體要求如下：

4.1陽性參考品及陽性質(zhì)控品：

4.1.1陽性參考品

理想狀態(tài)下，陽性參考品應(yīng)當(dāng)包括對(duì)所申報(bào)產(chǎn)品每個(gè)基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測(cè)基因數(shù)量較多，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、臨床意義及基因類型等因素進(jìn)行針對(duì)性和代表性的設(shè)計(jì)。

對(duì)于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應(yīng)考慮該類基因參考品設(shè)置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點(diǎn)基因，建議采用臨床樣本或細(xì)胞系提取的核酸儲(chǔ)備液作為原料。

對(duì)于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，應(yīng)考慮代表性問題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。

如檢測(cè)編碼區(qū)較大且存在非熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)（如大于1M），建議在陽性參考品中考慮對(duì)檢測(cè)整體區(qū)域的靈敏度驗(yàn)證（主要關(guān)注SNV等），如混合的永生化正常人白細(xì)胞DNA儲(chǔ)存液等。

不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)陽性參考品時(shí)可一并考慮檢測(cè)限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。

4.1.2陽性質(zhì)控品

模擬病人樣本的目標(biāo)核酸序列，并用于質(zhì)控整個(gè)檢測(cè)過程，包括核酸提取（如適用）、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。目前陽性質(zhì)控檢測(cè)和分析過程應(yīng)與臨床樣本方式一致。

4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品

陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細(xì)胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因。

4.3精密度參考品

精密度參考品設(shè)置要求可參考陽性/陰性參考品。

4.4 PCR 試劑無模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品特點(diǎn)設(shè)置NTC質(zhì)控品及檢測(cè)接受標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測(cè)檢測(cè)過程中是否存在污染。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

NGS檢測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的工作流程，它由很多獨(dú)立步驟組合而成。一般而言，對(duì)于每個(gè)檢測(cè)組成部分，申請(qǐng)人應(yīng)建立其特定檢測(cè)的指標(biāo)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。必須對(duì)NGS每個(gè)操作流程的性能表現(xiàn)進(jìn)行一個(gè)內(nèi)部的驗(yàn)證。每步流程都需要分別優(yōu)化到一個(gè)最佳經(jīng)驗(yàn)值，以此來綜合決定最佳的實(shí)驗(yàn)操作條件及各參數(shù)的設(shè)置。

1.應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求。

2.主要生產(chǎn)工藝、反應(yīng)原理介紹。逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）及最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）濃度、陽離子濃度等。

3.申報(bào)產(chǎn)品如包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。如包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測(cè)方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測(cè)方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法等。

（四）分析性能評(píng)估資料

分析性能評(píng)估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)置是否合理的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。檢測(cè)試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床預(yù)期用途，使用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

本部分內(nèi)容將從NGS檢驗(yàn)流程中的質(zhì)量控制要求和主要性能指標(biāo)兩部分進(jìn)行闡述：

1.NGS檢驗(yàn)流程

檢測(cè)方法中，應(yīng)明確所有檢測(cè)要素（如儀器、軟件、消耗品、試劑）。確定設(shè)計(jì)方案和標(biāo)準(zhǔn)并詳細(xì)記錄設(shè)計(jì)研究過程。對(duì)于基于NGS的檢測(cè)的每個(gè)組成，應(yīng)該確定規(guī)范并記錄。記錄每個(gè)檢測(cè)組成對(duì)于關(guān)鍵因素（如覆蓋率、堿基質(zhì)量等）的局限性。確定并記錄基因組的檢測(cè)區(qū)域，包括基因和變異類型，如果關(guān)鍵的測(cè)序區(qū)域不符合最低性能要求（如最小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)等），則應(yīng)修改檢測(cè)并重新驗(yàn)證以達(dá)到最低性能要求。同時(shí)，應(yīng)在產(chǎn)品說明書和/或標(biāo)簽中明確可能影響或限制產(chǎn)品檢測(cè)性能情形。

1.1樣本制備

申請(qǐng)人需考慮可接受檢測(cè)的樣本類型對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，應(yīng)明確組織樣本采集標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。用于腫瘤組織突變基因檢測(cè)的標(biāo)本，在進(jìn)行檢測(cè)前，須對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。腫瘤細(xì)胞所占比例需達(dá)到后續(xù)檢測(cè)方法的要求。

在NGS檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)開發(fā)過程中，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取、分離、純化及富集試劑進(jìn)行驗(yàn)證并提供驗(yàn)證方案的依據(jù)，應(yīng)明確樣品質(zhì)量（包括但不限于核酸濃度、純度及完整性）的最低要求并進(jìn)行質(zhì)量控制。如分離/純化后的核酸儲(chǔ)備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。

1.2測(cè)序文庫(kù)制備

文庫(kù)制備是產(chǎn)生特定大小范圍的DNA或cDNA片段的過程。文庫(kù)質(zhì)量非常重要，申請(qǐng)人應(yīng)建立文庫(kù)構(gòu)建濃度、文庫(kù)片段大小要求，文庫(kù)濃度檢測(cè)方法包括但不限于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法；文庫(kù)片段大小檢測(cè)方法包括但不限于毛細(xì)管電泳法等。申請(qǐng)人應(yīng)關(guān)注不同測(cè)序平臺(tái)的性能特點(diǎn)，確保片段長(zhǎng)度分布符合后續(xù)測(cè)序要求。如需要進(jìn)行片段化處理。申請(qǐng)人應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案。對(duì)經(jīng)過片段化的核酸短序列的濃度及片段分布等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

文庫(kù)制備的關(guān)鍵步驟是在DNA片段的兩端連接測(cè)序接頭，接頭序列是一段人為設(shè)計(jì)的序列，包含用于測(cè)序過程的多個(gè)目的的多個(gè)序列組分。如啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)的通用測(cè)序引物序列，用于PCR擴(kuò)增引物序列、錨定序列、索引（條形碼）序列等。如申請(qǐng)人采用自定義序列，應(yīng)提供設(shè)計(jì)依據(jù)及研究資料。加接頭可以是獨(dú)立的步驟，也可以在靶向序列富集過程中添加。申請(qǐng)人使用條碼或標(biāo)簽時(shí)，需充分驗(yàn)證并滿足測(cè)序的質(zhì)量要求，如測(cè)序深度、覆蓋度等條件。申請(qǐng)人應(yīng)報(bào)告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對(duì)每個(gè)條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有詳細(xì)、清晰的記錄。

1.3測(cè)序及堿基讀取

目前可用的測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序方法，包括聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法、邊合成邊測(cè)序和離子半導(dǎo)體測(cè)序，以及不同的檢測(cè)方法。盡管技術(shù)性能相似，但平臺(tái)之間存在差異，特別是不同的DNA輸入量要求、不同的測(cè)序通量、運(yùn)行時(shí)間、測(cè)序讀長(zhǎng)和不同的堿基識(shí)別技術(shù)。這些差異會(huì)影響儀器處理低質(zhì)量樣本的能力、檢測(cè)插入/缺失/融合等變異類型的能力以及樣本通量。

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)所選用的測(cè)序平臺(tái)，選擇合適的參數(shù)指標(biāo)對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并明確失控情況下的糾正措施。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測(cè)序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測(cè)序所需要的覆蓋度及深度。在測(cè)序過程中，申請(qǐng)人應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個(gè)測(cè)序過程中的測(cè)序質(zhì)量。

申請(qǐng)人應(yīng)描述清晰，如在確立測(cè)序深度時(shí)需要明確指出是平均測(cè)序深度還是最低測(cè)序深度；還需要說明測(cè)序數(shù)據(jù)類型，如原始測(cè)序數(shù)據(jù)（原始reads數(shù)）、過濾之后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)或去除重復(fù)之后的測(cè)序深度。

堿基識(shí)別是指識(shí)別一段基因序列片段每一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的過程。不同測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序偏好性，可影響堿基讀取過程中的錯(cuò)誤類型與比率。堿基讀取后，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)每個(gè)堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。

1.4生物信息學(xué)分析

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。申請(qǐng)人應(yīng)建立生物信息學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，保證測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析流程應(yīng)描述清晰，包括每一步驟使用軟件的名稱、版本、參數(shù)設(shè)置要求，包括但不限以下指標(biāo)：說明檢查每個(gè)位點(diǎn)的堿基質(zhì)量值和每個(gè)讀段的平均質(zhì)量值，堿基的頻率分布，讀長(zhǎng)分布及是否存在重復(fù)序列和人工序列的評(píng)價(jià)方法，以保證按照該流程生物信息學(xué)分析結(jié)果可復(fù)現(xiàn)。生物信息學(xué)分析應(yīng)至少報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。

生物信息學(xué)分析一般包括但不限于數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)比對(duì)及質(zhì)控、變異識(shí)別和變異注釋。根據(jù)測(cè)序類型和檢測(cè)報(bào)告的變異類型選擇生物信息流程，并考慮變異識(shí)別和評(píng)估流程過程中的限制因素以及第三方生物信息學(xué)工具對(duì)整個(gè)生物信息流程的影響。

1.4.1數(shù)據(jù)預(yù)處理：申請(qǐng)人應(yīng)說明分析流程使用的軟件類型及數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟。數(shù)據(jù)文件（如FASTQ格式文件）應(yīng)包含質(zhì)控參數(shù)，如每個(gè)位點(diǎn)堿基質(zhì)量值的控制參數(shù)、GC含量以及序列長(zhǎng)度分布等。明確測(cè)序堿基質(zhì)量值（Base Call Quality，如質(zhì)量值Q值得分）的閾值。明確判定實(shí)驗(yàn)有效的符合堿基質(zhì)量值的最低百分比。如采用其他方法，應(yīng)提供研究資料及選擇依據(jù)。

1.4.2數(shù)據(jù)比對(duì)及質(zhì)控：申請(qǐng)人應(yīng)提供BAM （Sequence Alignment/Map）文件生成過程軟件類型，每個(gè)樣本數(shù)據(jù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以及判定實(shí)驗(yàn)有效的最低接受標(biāo)準(zhǔn)。提供參考序列的選擇依據(jù)，如為特殊序列，應(yīng)提供采用該序列的依據(jù)。

1.4.3突變分析：根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)的基因類型，申請(qǐng)人應(yīng)確認(rèn)軟件工具類型及選擇依據(jù)。明確不同基因類型質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以及判定實(shí)驗(yàn)有效的最低接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4突變注釋：申請(qǐng)人應(yīng)提供每個(gè)突變預(yù)測(cè)的功能性作用以及臨床解釋注釋的形成過程及數(shù)據(jù)來源依據(jù)。

1.5軟件研究（如適用）

根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品預(yù)期用途，可能存在一些軟件產(chǎn)品不包含在申報(bào)產(chǎn)品組成成分中，但生物信息分析過程中需要用到該軟件，則該軟件被視為檢測(cè)系統(tǒng)一部分，申請(qǐng)人應(yīng)提供該部分軟件相關(guān)適用性研究資料。

1.6 NGS數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)、傳輸與共享（如適用）

用于儲(chǔ)存原始和經(jīng)過分析后的檢測(cè)結(jié)果。建議申請(qǐng)人提交數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級(jí)方案以及異常情況處置方案等資料。

1.7公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用（如適用）

如申報(bào)產(chǎn)品的測(cè)序結(jié)果需要借助公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)果注釋或報(bào)告解讀，申請(qǐng)人需提供所使用的公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)在產(chǎn)品檢測(cè)中起到的作用說明，公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)類型、功能介紹、版本號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案等。

2.主要性能指標(biāo)

分析性能驗(yàn)證包括通過一組預(yù)定義性能評(píng)價(jià)方式，以證明性能是否足以滿足其預(yù)期用途并符合預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)。通常涉及是否符合統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)要求，或檢測(cè)是否存在與患者的疾病相關(guān)的變異等。

2.1分析性能用樣本設(shè)置要求

申請(qǐng)人應(yīng)提供用于評(píng)估各項(xiàng)性能研究的標(biāo)本數(shù)量和類型設(shè)定的依據(jù)。根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，樣本研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型。研究應(yīng)考慮與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域，跨不同基因區(qū)域的變異、難以測(cè)序或難以比對(duì)的基因區(qū)域，人工混合嵌合體以及任何其他變異類型、檢測(cè)區(qū)域。例如：如果檢測(cè)旨在用于檢測(cè)和報(bào)告插入、缺失位點(diǎn)等，應(yīng)包括但不限于不同大小的基因片段、突變所在區(qū)域等。

應(yīng)在研究中使用含有與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床樣本，臨床樣本應(yīng)具有適當(dāng)?shù)拇硇?，確保可覆蓋申報(bào)產(chǎn)品聲稱的臨床相關(guān)序列變異等。

2.2準(zhǔn)確性

2.2.1總體要求

準(zhǔn)確性包括對(duì)比檢測(cè)值與被檢測(cè)值之間一致性。對(duì)于基于NGS測(cè)序原理的檢測(cè)，通過與適當(dāng)?shù)膶?duì)比方法比較，如核酸測(cè)序或其他經(jīng)過驗(yàn)證的方法，評(píng)估申報(bào)產(chǎn)品準(zhǔn)確性能。根據(jù)檢測(cè)的性能指標(biāo)，準(zhǔn)確性研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型驗(yàn)證（準(zhǔn)確性研究樣本要求詳見2.1分析性能用樣本設(shè)置要求）。

對(duì)于每種變異類型以及代表性臨床相關(guān)變異，應(yīng)考慮變異頻率。對(duì)于變異類型，為了確定檢測(cè)的變異類型以及檢測(cè)它們的測(cè)序區(qū)域（不管變異是否具有致病性），可以使用具有代表性的參考物質(zhì)或具有高置信度的樣本進(jìn)行研究。對(duì)于臨床相關(guān)的變異，準(zhǔn)確性計(jì)算包含使用基于臨床樣本的研究數(shù)據(jù)與臨床樣本相關(guān)的指標(biāo)。

準(zhǔn)確性研究中應(yīng)含有代表性臨床相關(guān)變異與檢測(cè)適應(yīng)癥的臨床樣本，以確保臨床相關(guān)序列變異被檢測(cè)和報(bào)告。準(zhǔn)確性評(píng)估如采用前瞻性臨床樣本時(shí)，收集和處理的方式應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途一致。如果前瞻性的臨床樣本不可用，則可以使用臨床相關(guān)區(qū)域中含有特定變異的凍存臨床樣本或人類細(xì)胞系樣本替代或補(bǔ)充研究。

根據(jù)待評(píng)價(jià)方法和對(duì)比方法對(duì)所有變異的檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)算陽性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）、陰性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）、陽性預(yù)測(cè)值（Positive Predictive Value，PPV）。通過檢測(cè)評(píng)估的每種類型的變異，如單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Variant，SNV）、插入、結(jié)構(gòu)變異，和測(cè)序區(qū)域范圍（如高度同源、高度多態(tài)或其他困難的區(qū)域），分別計(jì)算PPA、NPA等。

表1注：PPA通過將A（真陽性結(jié)果數(shù)）除以（A+C）、NPA通過將D（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（B+D）。這些計(jì)算不應(yīng)包含任何無應(yīng)答或無效應(yīng)答，無應(yīng)答或無效應(yīng)答結(jié)果應(yīng)被單獨(dú)列出（見表2）。根據(jù)適用情況計(jì)算每種變體類型以及臨床相關(guān)變異PPA、NPA等。

表2注：準(zhǔn)確性研究中無應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比應(yīng)該被估計(jì)為（E + F）/ N以及95％的雙側(cè)置信區(qū)間。此外，應(yīng)評(píng)價(jià)陽性結(jié)果中的無應(yīng)答或無效應(yīng)答E /（A + C + E）和陰性結(jié)果中的無應(yīng)答或無效應(yīng)答F /（B + D + F）。申請(qǐng)人應(yīng)設(shè)定無應(yīng)答或無效應(yīng)答的最小可接受標(biāo)準(zhǔn)并提供依據(jù)。樣本總數(shù)（N = A + B + C + D + E + F）。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)無應(yīng)答或無效應(yīng)答產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，注意區(qū)分無應(yīng)答或無效結(jié)果與模棱兩可結(jié)果，如質(zhì)控正常但結(jié)果無法識(shí)別的情況等。

2.2.2參考品準(zhǔn)確性

各水平、各突變位點(diǎn)的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條件下均應(yīng)檢出為陰性。

2.3檢測(cè)限

明確可接受的最低檢測(cè)限（Limit of Detection，LoD），并明確無效應(yīng)答或無應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)。為預(yù)期用途中包含的每種變異類型建立LoD。如果檢測(cè)人工混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測(cè)限。

試劑LoD的研究中應(yīng)在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室條件和確定的樣本類型下進(jìn)行。通常，LoD值采用分析物最低濃度計(jì)算得出，在此濃度下，可從相應(yīng)檢測(cè)重復(fù)中獲得至少95%的陽性檢出和可接受水平的無應(yīng)答或無效應(yīng)答。當(dāng)不同的變異類型可能具有不同的LoD時(shí)，需要計(jì)算不同的序列被測(cè)區(qū)域范圍中的每個(gè)變異類型的LoD。NGS檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)多種類型突變基因，因此靈敏度的設(shè)置應(yīng)根據(jù)不同突變基因類型及判讀方式進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4空白限（檢測(cè)基線）

應(yīng)確認(rèn)不會(huì)對(duì)報(bào)告區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或覆蓋率產(chǎn)生負(fù)面影響。應(yīng)包含具有代表性的基因區(qū)域、變異類型和序列背景進(jìn)行驗(yàn)證研究。設(shè)置空白檢測(cè)限檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定評(píng)價(jià)方案及方法。

2.5分析特異性

分析特異性是評(píng)估產(chǎn)品僅可檢測(cè)到預(yù)期待測(cè)變異的能力。根據(jù)預(yù)期用途和產(chǎn)品設(shè)計(jì)，一些潛在的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾和交叉反應(yīng)或交叉污染可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)性能產(chǎn)生影響。

交叉反應(yīng)（如同源區(qū)域、假基因和其他類型的交叉反應(yīng)序列）可能導(dǎo)致錯(cuò)誤檢測(cè)，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果?；颊邩?biāo)本的交叉污染可能將其他不正常的序列引入到檢測(cè)中，從而導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)選擇產(chǎn)品預(yù)期用途所覆蓋樣本或樣本類型以及DNA提取方法中相關(guān)的干擾物質(zhì)開展研究。同時(shí)，應(yīng)對(duì)已知交叉反應(yīng)的等位基因和同源區(qū)域進(jìn)行評(píng)估。

2.6精密度

精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測(cè)臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測(cè)（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測(cè)天數(shù)，不同儀器等），并考慮檢測(cè)中主要的變異來源。申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)估變異和野生型基因的精密度，其中應(yīng)分別報(bào)告不同檢測(cè)區(qū)域和變異類型的檢測(cè)值。申請(qǐng)人應(yīng)使用客觀證據(jù)和有效的統(tǒng)計(jì)方法來驗(yàn)證這些指標(biāo)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果多樣性的主要因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括但不限于檢測(cè)多個(gè)樣本、不同檢測(cè)批間、不同適用機(jī)型、試劑批次、檢測(cè)天數(shù)和操作員。

此外，申請(qǐng)人應(yīng)考慮外部因素相同的情況下，應(yīng)進(jìn)行申報(bào)試劑在相同或相似被測(cè)物的重復(fù)性檢測(cè)以評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果。申請(qǐng)人需對(duì)每個(gè)檢測(cè)條件和檢測(cè)區(qū)域下每個(gè)變異類型精密度分別進(jìn)行報(bào)告，還應(yīng)報(bào)告無應(yīng)答或無效應(yīng)答的百分比。

2.7體細(xì)胞與胚系突變鑒別研究（如適用）

申請(qǐng)人需提交資料明確申報(bào)產(chǎn)品如何有效鑒別胚系突變，申請(qǐng)人無論使用何種方法，都應(yīng)遵循保證準(zhǔn)確檢測(cè)的原則。如：對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)對(duì)該患者正常配對(duì)樣本（正常癌旁組織或外周血白細(xì)胞）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)配對(duì)樣本與癌組織樣本中鑒定出的突變信息進(jìn)行鑒別篩選，應(yīng)確認(rèn)樣本中特有的基因多態(tài)性，并明確混合后的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的預(yù)期頻率。當(dāng)無配對(duì)樣本時(shí)，申請(qǐng)人需提供如何有效區(qū)分體細(xì)胞突變和胚系突變鑒定標(biāo)準(zhǔn)并提供相關(guān)研究資料。

2.8批次互通性（如適用）

NGS的檢測(cè)通常包括試劑，消耗品，儀器和軟件。各部分相對(duì)獨(dú)立，申請(qǐng)人需對(duì)各批次之間是否互通進(jìn)行研究。

2.9生物分析流程的性能補(bǔ)充研究（如適用）

當(dāng)臨床樣本、細(xì)胞系或生物合成材料不可用或無法完全覆蓋生物分析流程時(shí)，可以使用含有各種要求類型的已知序列變異（如：SNV、插入、缺失、結(jié)構(gòu)變異等）的計(jì)算機(jī)構(gòu)建的序列標(biāo)本。申請(qǐng)人可采用軟件編輯滿足驗(yàn)證需要的模擬樣本或數(shù)學(xué)模型，對(duì)生物分析流程進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。這些數(shù)據(jù)文件應(yīng)使用與申報(bào)產(chǎn)品相同的預(yù)分析和分析方法來生成。需要注意，編輯樣本不能替代生物學(xué)樣本，只能作為生物學(xué)樣本不能滿足所有驗(yàn)證條件下的補(bǔ)充情形。

2.10其他

評(píng)估檢測(cè)局限性時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)采用特殊樣本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并確定檢測(cè)無法以預(yù)期的準(zhǔn)確度和精確度檢測(cè)到的序列變化類型。如果這些區(qū)域是申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)預(yù)期用途的一部分，則需要驗(yàn)證高度同源、高度多態(tài)或其他困難區(qū)域的變異的檢測(cè)性能。如果被檢測(cè)的基因區(qū)域的一部分難以測(cè)序并且不能達(dá)到性能閾值，則應(yīng)該將其報(bào)告為檢測(cè)局限性。如適用，申請(qǐng)人應(yīng)記錄申報(bào)產(chǎn)品不會(huì)報(bào)告的檢測(cè)類型。

在設(shè)計(jì)和驗(yàn)證過程中，申請(qǐng)人應(yīng)記錄所有檢測(cè)失敗情況并分析原因。例如，由于未能滿足其一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)運(yùn)行質(zhì)量指標(biāo)等。不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)區(qū)域不應(yīng)報(bào)告變異結(jié)果。由于未能達(dá)到檢測(cè)運(yùn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而未被檢測(cè)到的區(qū)域，則應(yīng)如實(shí)報(bào)告。

申報(bào)產(chǎn)品上市后，通過上市后臨床數(shù)據(jù)收集和分析或藥品說明書中明確具有伴隨診斷用途的基因，在不改變?cè)蟹磻?yīng)體系和檢測(cè)方式等情況，申請(qǐng)人可通過收集本產(chǎn)品臨床有效性資料申請(qǐng)變更其臨床用途。

三、名稱解釋

通量測(cè)序（High-throughput sequencing）：又稱下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing），可以一次性對(duì)數(shù)百萬條核酸分子進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。

全基因組測(cè)序：對(duì)某種生物基因組中的全部堿基進(jìn)行測(cè)序，即把細(xì)胞內(nèi)完整的基因組序列從第一個(gè)DNA分子開始直到最后一個(gè)DNA分子完整檢出，并按順序排列。

從頭測(cè)序（de novo sequencing）：即不依賴于任何已知的基因組參考序列和其他序列信息，而直接對(duì)某個(gè)物種的全基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，然后利用生物信息學(xué)工具對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行拼接和組裝，從而獲得該基因組的全序列或連續(xù)的大片段。

永生化正常人白細(xì)胞：將正常人的白細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等，導(dǎo)入目的細(xì)胞內(nèi)以增加永生化的發(fā)生率，從而得到的永生化細(xì)胞株。

變異豐度：變異基因型在所有基因型中所占的比例，計(jì)算方式為變異基因型數(shù)量除以野生型和變異型基因總量。

變異頻率：變異基因型在總?cè)巳褐械幕蝾l率。

原始reads數(shù)：經(jīng)過高通量測(cè)序后，測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)總reads數(shù)。

有效測(cè)序深度（如經(jīng)過去重處理等）：去除PCR重復(fù)等后的平均深度。

符合最低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度要求的區(qū)域（%）：最低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度均大于閾值的區(qū)域數(shù)與區(qū)域總數(shù)的比值。

GC含量（GC content）：在測(cè)序所得的所有堿基中G（鳥嘌呤）和C（胞嘧啶）兩種堿基數(shù)與所有堿基數(shù)的比值。

覆蓋率：測(cè)序覆蓋區(qū)域占總目標(biāo)區(qū)域的比例。

最小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)序覆蓋區(qū)域占總目標(biāo)區(qū)域的最小比例閾值。

堿基識(shí)別質(zhì)量值（base call quality scores）：衡量測(cè)序質(zhì)量的重要指標(biāo)，指測(cè)序得到的堿基的可靠性程度，基因的高通量測(cè)序中，每測(cè)一個(gè)堿基會(huì)給出一個(gè)相應(yīng)的質(zhì)量值（base call quality，Q），用于衡量測(cè)序準(zhǔn)確度。質(zhì)量值越高表示堿基識(shí)別越可靠，堿基被測(cè)錯(cuò)的概率越小。

錨定序列：測(cè)序芯片上隨機(jī)分布的兩種不同的寡核苷酸序列，用于與測(cè)序文庫(kù)結(jié)合。

索引（條形碼）序列：index標(biāo)簽序列或barcode標(biāo)簽序列，指在文庫(kù)構(gòu)建過程中引入的一段標(biāo)簽序列，用于多樣品同時(shí)測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣本的序列。    

無應(yīng)答或無效應(yīng)答：測(cè)序結(jié)果失敗或測(cè)序數(shù)據(jù)低于質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果無效。

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五、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。