附件：結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2018年第57號）.doc

結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑
注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，如不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)（即γ-干擾素釋放試驗，IGRAs）的主要原理：受到結(jié)核分枝桿菌抗原刺激致敏的T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）再次遇到相同抗原時可產(chǎn)生γ-干擾素，IGRAs通過檢測全血或者分離自全血的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下產(chǎn)生的γ-干擾素，判斷受試者是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。目前，國際上較成熟的IGRAs有兩種：一是采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）方法檢測全血中致敏T細(xì)胞再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后釋放的γ-干擾素水平；二是采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）方法測定在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下，外周血單個核細(xì)胞中能夠釋放γ-干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量。

上述兩種檢測方法的原理類似，檢測技術(shù)和操作程序略有不同，采用的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原主要存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺失。

目前，結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑是指：利用免疫學(xué)檢測技術(shù)，如ELISA或ELISPOT技術(shù)等，以結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素為檢測靶標(biāo)，對人靜脈全血中的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行體外檢測的試劑，可用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測或用于結(jié)核病的輔助診斷。本指導(dǎo)原則所述內(nèi)容是針對結(jié)核病輔助診斷預(yù)期用途的，對于預(yù)期用途為結(jié)核分枝桿菌感染檢測的申報試劑，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進(jìn)行修訂或補充其他的評價和驗證。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，對于其他方法，可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進(jìn)行修訂或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學(xué)合理性。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從預(yù)期用途、方法學(xué)、檢驗原理、結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原以及最低檢測限等方面寫明申報試劑與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。如所用刺激抗原為新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，則應(yīng)詳細(xì)論述其能提高該類試劑靈敏度和特異性的科學(xué)依據(jù)，并提供充分的支持資料。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號，以下簡稱44號公告）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料的研究資料

應(yīng)提供主要原材料如抗原肽/重組抗原、抗體、陰性對照、陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)品（γ-干擾素）、酶以及企業(yè)參考品等的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。如主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；如主要原材料購自其他供應(yīng)商，應(yīng)提供的資料包括：供應(yīng)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告或性能指標(biāo)證書，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

企業(yè)參考品：申請人應(yīng)提供企業(yè)參考品的詳細(xì)的來源、制備和確定等資料。

對于采用ELISPOT方法的申報試劑，企業(yè)參考品至少應(yīng)包括：陰性參考品、陽性參考品和精密度參考品。其中，陽性參考品建議采用結(jié)核病患者（菌陰和菌陽）的全血，陰性參考品建議采用健康人和其他易混淆疾病患者的全血，精密度參考品建議采用結(jié)核病患者的全血。如申請人采用除全血之外的其他樣本形式作為企業(yè)參考品，請?zhí)峤簧暾埲怂捎玫钠髽I(yè)參考品的組成、來源、穩(wěn)定性、延續(xù)性、性能可控性等詳細(xì)的理論和試驗數(shù)據(jù)。

對于采用ELISA方法的申報試劑，企業(yè)參考品至少應(yīng)包括：陰性參考品、陽性參考品、最低檢測限參考品、線性參考品、準(zhǔn)確度參考品和精密度參考品等。其中，陰性參考品、陽性參考品和精密度參考品的設(shè)置可參考ELISPOT方法申報試劑的相關(guān)要求。最低檢測限參考品、準(zhǔn)確度參考品和線性參考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有γ-干擾素的溶液（建議采用血漿作為基質(zhì)溶液）。

對于陰性/陽性對照：申報試劑的質(zhì)控體系通過設(shè)置陽性、陰性對照來實現(xiàn)，申報資料應(yīng)詳細(xì)描述各種對照的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，對于采用上述方法學(xué)的結(jié)核細(xì)胞類檢測試劑，建議至少設(shè)置陽性對照和陰性對照。陽性對照一般采用外周血單個核細(xì)胞非特異性刺激物，用于質(zhì)控外周血單個核細(xì)胞功能是否正常，避免產(chǎn)生假陰性。陰性對照用于控制細(xì)胞在活化過程中所產(chǎn)生的各種因子的非特異性影響，避免產(chǎn)生假陽性。

標(biāo)準(zhǔn)品（如適用）的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)詳細(xì)描述標(biāo)準(zhǔn)品原料的來源、制備、純度、濃度（或復(fù)溶后濃度）、分子量、功能活性等的確定和驗證資料。

多肽/重組抗原的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)詳細(xì)描述多肽的來源（來自何種抗原）/重組抗原的來源、組成、分子量、純度、濃度、重組抗原的內(nèi)毒素含量、刺激活性、特異性等的確定和驗證資料。如為凍干抗原，還應(yīng)設(shè)置水分含量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

抗體的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)詳細(xì)描述抗體的來源、純度、濃度、分子量、刺激免疫原、效價和功能活性等的確定和驗證資料。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝包括：配制工作液、分裝和包裝等，可用流程圖表示。應(yīng)提供主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)，包括試驗方法和數(shù)據(jù)等。

反應(yīng)體系研究資料應(yīng)能對產(chǎn)品說明書中檢驗方法部分涉及的基本內(nèi)容，如樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件等，提供確定的依據(jù)，包括試驗方法和數(shù)據(jù)等。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交對申報試劑進(jìn)行的所有性能驗證的研究資料，包括具體的試驗方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析等。對于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑，建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.對于采用ELISA方法的申報試劑

檢驗方法分為兩大部分：（1）將結(jié)核分枝桿菌特異性抗原與全血樣本共培養(yǎng)，獲得含有γ-干擾素的血漿樣本；（2）以γ-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對第（1）步的血漿樣本采用ELISA方法進(jìn)行定量檢測。基于該方法學(xué)的分析性能，需要對上述兩方面的性能均進(jìn)行驗證。

1.1最低檢測限

申請人可采用合理方法確定和驗證申報試劑的最低檢測限。建議采用含有系列γ-干擾素稀釋濃度的樣本，對每個濃度樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測，選取測定平均OD值-2SD大于0濃度測定平均OD值+2SD的濃度作為最低檢測限濃度。

1.2線性范圍

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值樣本（采用血漿基質(zhì)，采用可溯源至國際校準(zhǔn)品的方法對血漿樣本中的γ-干擾素進(jìn)行定量）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液應(yīng)使用血漿，應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度。通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系確定申報試劑的線性范圍。

1.3準(zhǔn)確度

可采用如下方法進(jìn)行評價，如：與國際標(biāo)準(zhǔn)品的偏差分析、回收試驗或者方法學(xué)比對等方法，申請人可根據(jù)實際情況選擇合理方法進(jìn)行研究。

1.4分析特異性

1.4.1交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)的驗證主要考慮全血自身含有的細(xì)胞因子或全血刺激培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與申報試劑所用γ-干擾素抗體對是否存在交叉反應(yīng)。需要進(jìn)行交叉反應(yīng)驗證的細(xì)胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建議在0濃度γ-干擾素水平和中濃度γ-干擾素水平分別進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。

同時，建議申請人采用一定數(shù)量的其他常見分枝桿菌感染患者的全血樣本進(jìn)行試驗，評價申報試劑的特異性。

1.4.2干擾物質(zhì)

應(yīng)對全血樣本中常見的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗證，包括：抗凝劑、甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素、類風(fēng)濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體和免疫抑制劑等。建議采用含有不同濃度γ-干擾素的血漿樣本分別進(jìn)行干擾物質(zhì)的驗證，給出不會對γ-干擾素檢測值產(chǎn)生干擾的最高干擾物濃度。

1.5精密度

1.5.1采用全血樣本進(jìn)行試驗的精密度：分別采用陽性全血樣本和陰性全血樣本，進(jìn)行不少于10次重復(fù)檢測，判斷檢測結(jié)果的陰陽性，多次重復(fù)檢測結(jié)果應(yīng)一致。

1.5.2采用含有γ-干擾素的血漿樣本進(jìn)行試驗的精密度：建議在γ-干擾素低濃度和中等濃度2個濃度水平分別進(jìn)行驗證。

1.5.2.1低濃度樣本：γ-干擾素濃度略高于試劑盒的最低檢測限（n≥20）。

1.5.2.2中等濃度樣本：采用中等濃度的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，CV≤15%（n≥20）。

1.5.3申請人應(yīng)設(shè)置合理的精密度評價周期，以便對批內(nèi)/批間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。

1.6陰性參考品符合率

建議選擇至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血樣本進(jìn)行試驗，上述健康人和患者應(yīng)包括不同等級的結(jié)核菌素（PPD）皮試人群。

1.7陽性參考品符合率

建議選擇至少20份結(jié)核病患者（至少10例菌陽，至少10例菌陰）全血樣本進(jìn)行試驗。

1.8標(biāo)準(zhǔn)品的溯源資料

γ-干擾素具有國際標(biāo)準(zhǔn)品，建議檢測結(jié)果的量值溯源至國際標(biāo)準(zhǔn)品。申請人應(yīng)提供從國際標(biāo)準(zhǔn)品到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)品的溯源鏈以及各級賦值資料。

2.對于采用ELISPOT方法的申報試劑

檢驗方法為：將結(jié)核分枝桿菌特異性抗原與分離的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）共培養(yǎng)，活化刺激PBMC分泌的γ-干擾素被微孔板上包被的單克隆抗體捕獲，再用酶標(biāo)記的另一個單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)顯色，一個斑點即代表一個細(xì)胞，計數(shù)斑點的多少，從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)?；谠摲椒▽W(xué)的分析性能，需從下述幾個方面進(jìn)行性能驗證。

2.1分析特異性

2.1.1交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)的驗證主要考慮PBMC刺激培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與申報試劑所用γ-干擾素抗體對是否存在交叉反應(yīng)。需要進(jìn)行交叉反應(yīng)驗證的細(xì)胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建議在0濃度γ-干擾素水平和中濃度γ-干擾素水平分別進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。

同時，建議申請人采用一定數(shù)量的其他常見分枝桿菌感染患者的全血樣本進(jìn)行試驗，評價申報試劑的特異性。

2.1.2干擾物質(zhì)

應(yīng)對全血樣本中常見的干擾物質(zhì)進(jìn)行驗證，包括：抗凝劑、甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素、類風(fēng)濕因子、抗核抗體、抗線粒體抗體和免疫抑制劑等。建議采用全血樣本進(jìn)行干擾物質(zhì)的驗證，給出不產(chǎn)生干擾的最高干擾物濃度。

2.2精密度

采用全血樣本（包括高斑點數(shù)樣本、中等斑點數(shù)和低斑點數(shù)樣本）分別進(jìn)行精密度評價，進(jìn)行不少于10次重復(fù)試驗，判斷檢測結(jié)果的陰陽性，多次重復(fù)檢測結(jié)果應(yīng)一致。同時，還應(yīng)計數(shù)檢測孔斑點數(shù)，計算其CV值，CV值應(yīng)≤25%。

申請人應(yīng)設(shè)置合理的精密度評價周期，以便對批內(nèi)/批間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。

2.3陰性參考品符合率

建議選擇至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血樣本進(jìn)行試驗，上述健康人和患者應(yīng)包括不同等級的結(jié)核菌素（PPD）皮試人群。

2.4陽性參考品符合率

建議選擇至少20份結(jié)核病患者（至少10例菌陽，至少10例菌陰）全血樣本進(jìn)行試驗。

（五）陽性判斷值的研究資料

此類試劑的陽性判斷值較為復(fù)雜，陽性判斷值對應(yīng)產(chǎn)品說明書中“檢驗結(jié)果的解釋”部分的內(nèi)容，申請人應(yīng)對產(chǎn)品說明書中“檢驗結(jié)果的解釋”部分所涉及的各個數(shù)值提供詳細(xì)的確定和驗證資料。該部分資料應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行試驗，請注意臨床樣本的選擇應(yīng)與申報產(chǎn)品聲稱的預(yù)期用途相一致。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進(jìn)行確定。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性包括申報試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性（包括全血樣本穩(wěn)定性和血漿樣本穩(wěn)定性）。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開封穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制（如適用）等。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、44號公告和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的規(guī)定，以下僅結(jié)合結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑的具體特點對其臨床試驗中應(yīng)重點關(guān)注的內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.臨床試驗機構(gòu)的選擇

申請人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）臨床試驗機構(gòu)，按照法規(guī)要求開展臨床試驗。

2.對比試劑的選擇

對于預(yù)期用于結(jié)核病輔助診斷的申報試劑，申請人可選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱申報試劑）與對比試劑進(jìn)行比較研究試驗，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

3.臨床試驗對象的選擇

對于預(yù)期用于結(jié)核病輔助診斷的申報產(chǎn)品，臨床試驗對象應(yīng)滿足：（1）臨床試驗總病例至少1000例；（2）具有結(jié)核病相關(guān)體征/癥狀的疑似結(jié)核病患者；（3）最終臨床診斷為結(jié)核病患者的病例中，應(yīng)包括肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者，并且涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例不應(yīng)小于50%；單純肺外結(jié)核患者至少30例；（4）非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病的患者病例（最終臨床診斷不是結(jié)核病），包括肺炎、肺癌、支氣管炎、支氣管擴張、非結(jié)核分枝桿菌病、慢阻肺等，其中肺癌至少50例；（5）上述人群應(yīng)包括PPD陰性和陽性人群，不能人為選擇PPD陰性人群進(jìn)行臨床試驗；（6）各臨床試驗機構(gòu)的樣本量和樣本分布應(yīng)相對均衡。

全血樣本不能凍融，臨床試驗應(yīng)采用新鮮樣本，樣本采集和保存等應(yīng)滿足申報試劑和對比試劑說明書的相關(guān)要求。

4.臨床試驗方法、臨床原始數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

4.1分別依據(jù)申報試劑和對比試劑各自的說明書對入組臨床樣本進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果。

4.2臨床報告中應(yīng)明確：總樣本例數(shù)；臨床診斷為肺結(jié)核患者的總例數(shù)，說明涂片陰性和涂片陽性的肺結(jié)核患者例數(shù)；肺外結(jié)核患者的例數(shù)，說明各類肺外結(jié)核患者的例數(shù)；非結(jié)核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病樣本例數(shù)，并詳細(xì)說明各類非結(jié)核疾病的患者例數(shù)。

4.3臨床原始數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括每個病例樣本的年齡、性別、臨床診斷結(jié)果、申報試劑的結(jié)果以及對比試劑的結(jié)果等。

4.4對臨床試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。常選擇四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

4.5申報試劑對涂片陰性的肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者均應(yīng)有一定的檢出率。

5.結(jié)果差異樣本的驗證

對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三方試劑或其他合理方法進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

6.臨床試驗方案

各臨床試驗機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)保持一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床試驗機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申請人的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。各臨床試驗機構(gòu)選用的對比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。

7.其他問題

如果申報試劑的預(yù)期用途為結(jié)核分枝桿菌感染的檢測，申請人應(yīng)按照法規(guī)要求，設(shè)置合理的對比方法，選擇合適的預(yù)期適用人群，進(jìn)行臨床試驗。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的相關(guān)規(guī)定。內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗方法，并在附錄中明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。

對于采用ELISA方法的申報試劑，產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)至少應(yīng)包括：外觀、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率、線性、準(zhǔn)確度、最低檢測限和精密度等。對于采用ELISPOT方法的申報試劑，產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)至少應(yīng)包括：外觀、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率和精密度。

（九）產(chǎn)品注冊檢驗報告

根據(jù)《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。

（十）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進(jìn)行說明。

1.【預(yù)期用途】

應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人新鮮外周靜脈抗凝血中結(jié)核分枝桿菌特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測或者用于結(jié)核病的輔助診斷（根據(jù)臨床試驗等研究資料確認(rèn)預(yù)期用途）。

1.2說明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇以\斷方法。

1.3待測人群特征介紹：具有結(jié)核病相關(guān)體征/癥狀的疑似結(jié)核病患者、地域要求或年齡限制（如有）等。

2.【主要組成成分】

2.1說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關(guān)信息。

2.3申報試劑的注冊單元不應(yīng)包含真空采血管，真空采血管應(yīng)按相應(yīng)法規(guī)申報注冊。

3.【檢驗原理】

3.1說明試劑盒所用的刺激抗原/抗原肽（名稱、是否多肽抗原/重組抗原），以及所用抗原/抗原肽在卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌中的存在情況。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說明。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求（如適用）等，應(yīng)明確具體的儲存條件及有效期。

5.【樣本要求】

重點明確以下內(nèi)容：

5.1樣本的采集：明確所用抗凝劑。

5.2樣本的保存：

5.2.1對于采用ELISPOT方法的申報試劑，應(yīng)明確：全血樣本進(jìn)行外周血單個核細(xì)胞分離前的保存溫度與時間；分離后外周血單個核細(xì)胞在與抗原孵育培養(yǎng)前的保存溫度與時間。

5.2.2對于采用ELISA方法的申報試劑，應(yīng)明確：全血樣本在與抗原孵育培養(yǎng)前的保存溫度與時間。

6.【檢驗方法】

該類產(chǎn)品的檢測步驟繁多，應(yīng)詳細(xì)描述從全血采集開始到結(jié)果判讀前的每個步驟，并明確注意事項。重點關(guān)注以下問題：對于采用ELISPOT方法的申報試劑，明確培養(yǎng)時所用外周血單個核細(xì)胞的數(shù)量以及所用培養(yǎng)基類型。

7.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照以及樣本管檢測結(jié)果，以列表的形式對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述，明確灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

8.【檢驗方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析，如：某些免疫功能受損的患者，可能導(dǎo)致假陰性。

8.3有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析，如：與其他分枝桿菌是否存在交叉反應(yīng)。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

9.1最低檢測限（如適用）：說明試劑的最低檢出濃度，簡單介紹最低檢測限的試驗方法及結(jié)果。

9.2企業(yè)陰陽性參考品的檢測符合情況：簡單介紹陰陽性參考品的組成和符合率結(jié)果等信息。

9.3精密度：明確精密度參考品的組成及結(jié)果。

9.4分析特異性

9.4.1交叉反應(yīng)：明確可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他細(xì)胞因子的驗證情況。

9.4.2干擾物質(zhì)：明確樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

9.5對比試驗研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

9.6境外（如適用）和境內(nèi)臨床試驗數(shù)據(jù)總結(jié)。

《結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》編制說明

一、編制背景

結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測試劑是指利用免疫學(xué)檢測技術(shù)，如ELISA或ELISPOT技術(shù)等，以結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素為檢測靶標(biāo)，對人靜脈全血中的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行體外檢測的試劑，可用于結(jié)核分枝桿菌感染的檢測或用于結(jié)核病的輔助診斷。

本指導(dǎo)原則所述內(nèi)容是針對結(jié)核病輔助診斷預(yù)期用途的，對于預(yù)期用途為結(jié)核分枝桿菌感染檢測的申報試劑，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進(jìn)行修訂或補充其他的評價和驗證。

二、重點問題的說明

（一）企業(yè)參考品的組成和樣本類型

目前，該類試劑采用全血樣本作為檢測樣本類型，所涉及的方法學(xué)包括：ELISPOT和ELISA。針對企業(yè)參考品的樣本類型，考慮到全血樣本的不可凍存性和該類試劑質(zhì)控的關(guān)鍵點，指導(dǎo)原則建議：如申請人采用除全血之外的其他樣本形式作為企業(yè)參考品，應(yīng)提交申請人所采用的企業(yè)參考品的組成、來源、穩(wěn)定性、延續(xù)性、性能可控性等詳細(xì)的理論和試驗數(shù)據(jù)。

針對企業(yè)參考品的組成，由于ELISPOT方法是在全血細(xì)胞培養(yǎng)后，直接在固體基質(zhì)表面形成斑點，計數(shù)斑點判斷結(jié)果，理論上可計數(shù)一個斑點。但在實踐時，很難保證獲取的全血樣本剛好形成一個斑點，因此，采用該方法學(xué)的試劑僅需要設(shè)置陰性參考品、陽性參考品和精密度參考品。而ELISA方法是在全血培養(yǎng)后，吸出血漿上清，檢測上清中的干擾素的含量，因此，采用該方法學(xué)的此類試劑需要設(shè)置培養(yǎng)階段和干擾素ELISA檢測階段參考品，包括：陰性參考品、陽性參考品、線性參考品、最低檢測限參考品和精密度參考品等。

（二）分析性能評估相關(guān)問題

1.最低檢測限的要求與方法

采用ELISPOT方法的試劑，理論上可計數(shù)到一個斑點，因此理論上其最低檢測限為1個斑點，但現(xiàn)實中通過試驗證明該類試劑的最低檢測限為1個斑點具有很大困難，難以實現(xiàn)。因此，參考美國FDA已批準(zhǔn)同類試劑的要求，經(jīng)討論后，對ELISPOT方法學(xué)的此類試劑，無需進(jìn)行最低檢測限的驗證。

采用ELISA方法的試劑，最低檢測限檢測的是血漿樣本中干擾素的最低含量。指導(dǎo)原則建議，申請人可根據(jù)自己的研發(fā)平臺，設(shè)置科學(xué)合理的方法，進(jìn)行最低檢測限的試驗。

2.精密度的要求與方法

采用ELISPOT方法的試劑，精密度必須采用全血進(jìn)行試驗，方可模擬整個檢測過程。在討論日間精密度時，企業(yè)和相關(guān)專家均提出，因為全血樣本無法凍存，無法在不同的自然天內(nèi)進(jìn)行日間精密度的研究。同時，現(xiàn)有認(rèn)知水平下，也無科學(xué)合理的替代方法來進(jìn)行日間精密度的研究，因此，對此類試劑不做日間精密度的要求。

采用ELISA方法的試劑，精密度不僅需要考察全血培養(yǎng)階段的精密度，而且需要考察ELISA檢測部分對干擾素含量檢測的精密度，前者可參考ELISPOT方法的相關(guān)要求和方法，后者參考常見ELISA方法檢測試劑的要求和方法。

3.交叉反應(yīng)的要求與方法

采用ELISPOT方法和ELISA方法的試劑，盡管結(jié)果的判讀方式存在差異，但其檢驗原理均是采用特異性的γ-干擾素抗體，檢測T細(xì)胞刺激活化后分泌的γ-干擾素。因此，此類試劑的交叉反應(yīng)性，主要考慮全血自身含有的細(xì)胞因子或全血刺激培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與申報試劑所用γ-干擾素抗體對是否存在交叉反應(yīng)。

如果在全血樣本的培養(yǎng)過程中加入可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的細(xì)胞因子，勢必會影響T細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的功能和活性，最終影響T細(xì)胞分泌γ-干擾素的能力，影響對結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測。因此，對于該類試劑，不管是采用何種方法，交叉反應(yīng)的研究都是采用血漿或其他基質(zhì)檢測細(xì)胞因子對γ-干擾素抗體對的交叉反應(yīng)性。

（三）產(chǎn)品預(yù)期用途

該類試劑的檢測原理可檢測結(jié)核分枝桿菌的感染，包括活動性結(jié)核感染（結(jié)核病）和潛伏感染。但是，因為潛伏感染的診斷在全世界均無金標(biāo)準(zhǔn)，而且中國人出生就接種卡介苗，導(dǎo)致對潛伏感染預(yù)期用途的臨床驗證目前缺乏有效的對比方法，因此，目前申請人申報該類試劑的預(yù)期用途基本用于結(jié)核病的輔助診斷。本指導(dǎo)原則針對結(jié)核病輔助診斷預(yù)期用途的臨床試驗要求，給出了較為詳細(xì)的建議，并經(jīng)專家和企業(yè)討論后，達(dá)成了一致意見。

同時，指導(dǎo)原則也明確，如果申請人對該類試劑的預(yù)期用途設(shè)定為結(jié)核分枝桿菌感染的檢測，需提供足夠的臨床證據(jù)支持該聲稱。

（四）臨床試驗相關(guān)問題

1.樣本入組相關(guān)要求

針對結(jié)核病輔助診斷的預(yù)期用途，指導(dǎo)原則在臨床試驗樣本入組方面做了較為詳細(xì)的說明。申報試劑應(yīng)選擇疑似結(jié)核患者進(jìn)行檢測，以模擬臨床實際使用情況。臨床使用中，該類試劑不僅用于肺結(jié)核的輔助診斷，還可用于肺外結(jié)核的輔助診斷，因此，指導(dǎo)原則對單純肺外結(jié)核的樣本例數(shù)也給出了最低要求。鑒于臨床實踐和研究證明，肺癌患者是一類與γ-干擾素相關(guān)的癌癥，因此，規(guī)定了肺癌患者的最低樣本例數(shù)，以考察該類試劑的特異性。

2.臨床特異性的相關(guān)要求

指導(dǎo)原則初稿時，對申報試劑的臨床特異性做出了不低于75%的要求。后經(jīng)專家和企業(yè)反復(fù)討論后刪除了這一要求，原因有以下幾點：第一，該類試劑已有多個同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市，按照法規(guī)要求，可選擇已上市同類試劑，驗證該類試劑的檢測準(zhǔn)確性；第二，該類試劑的臨床特異性受臨床試驗受試人群的年齡、性別以及區(qū)域的影響較大，而且目前并無大量流行病學(xué)的調(diào)查數(shù)據(jù)支持75%的聲稱，因此，臨床特異性無法給出具體要求。

三、編寫單位

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。